重建已灭绝古人类——尼安德特人和丹尼索瓦人的全基因组、绘制全球人群迁徙交流历史、挖掘最古老东亚现代人“田园人”的遗传结构、揭示东亚人群末次盛冰期前后适应性基因的变化、追溯中国南北方人群格局的形成、溯源南岛语系人群的中国南方起源……在过去十余年里，研究人员利用古DNA技术发掘出那些遗落了成千上万年的遗传信息，从中抽丝剥茧，不断刷新人类对自身演化历程的认知。

　　7月21日，《细胞》发布特刊讨论了最新生物技术的前沿发展。bat365在线官网登录研究员付巧妹团队受邀领衔古DNA前沿领域针对古DNA技术发展与未来发表评述性论文。文章回顾了古DNA技术的发展历史和突破，探讨了目前的技术瓶颈和解决方案，以及未来古DNA技术的发展方向与前景。

　　　高通量测序将古DNA领域“一网打尽” 

　　高通量测序，又叫二代测序，是一种快速测定大量DNA序列的技术。在高通量测序普及之前，古DNA领域只能依赖PCR技术测定少数特定DNA片段的序列。

　　“这种方法获取的DNA信息极其有限，而且难以区分真正的古DNA和污染DNA。高通量测序理论上能测序样本中所有DNA分子的信息，且成本逐年降低。即使是含量极低的古DNA，也能很有效地对其进行测序。”付巧妹解释道。不仅如此，通过生物信息学手段，还能快速检测样本中是否存在古DNA损伤，从而达到鉴别古DNA的目的。这一方法也成了领域中古DNA检测的重要标准。

　　除此之外，研究人员还根据古DNA的特点，对高通量测序的实验方法（DNA文库构建）进行了多种调整与优化。

　　付巧妹提到，half-UDG处理和单链DNA文库的构建是最重要的两项技术突破。Half-UDG技术既能保留部分DNA末端损伤，又能修复大部分古DNA损伤，从而在保留古DNA特征的同时，提高古DNA测序结果的准确性。而单链DNA文库则针对古DNA中常常存在大量单链黏性末端的情况，直接将双链DNA变性成单链DNA构建文库，从而更有效地对受损的单链古DNA测序。

　　　DNA捕获技术挑战极限 

　　“尽管高通量测序已能较为有效地测序古DNA，但由于古DNA提取物中常常包含大量污染DNA，使得测序的大部分DNA分子都是没有用的信息，真正有用的古DNA序列常常只占测序数据的1%不到。”付巧妹表示。

　　对此，研究人员在古DNA领域研发应用了DNA捕获技术——通过设计DNA或RNA探针，像钓鱼一样把目标古DNA从海量的污染DNA中“钓取”出来。

　　这项技术目前已广泛应用于人类古基因组研究中，有超过2/3的人类古基因组数据来自于一个名为“1240k”的探针组捕获的数据。

　　“DNA捕获技术不仅使得古DNA测序效率大大提高，还能有效地从一些‘棘手’的样本中得到足够的数据用于分析。”付巧妹说。

　　一个典型的例子就是付巧妹团队去年发表在《细胞》上的古代南方人群的基因组研究。中国南方温暖、潮湿的环境和当地的酸性土壤十分不利于古DNA的保存，使得这片区域的古DNA研究一度处于空白状态。当时，正是利用DNA捕获技术，付巧妹团队成功获取了30个古南方人群的基因组信息，揭示了1万余年以来东亚和东南亚交汇处的人群遗传史。

　　最近，古DNA研究人员进一步挑战极限，摆脱化石的桎梏，直接从“土”里提取古DNA。这项技术已成功应用于丹尼索瓦洞和白石崖溶洞，成功获取了数万年前的已灭绝古人类的DNA。古DNA技术不断迭代、“浪里淘金”的过程仍在持续。

　　　未来要攻克的难关 

　　虽然古DNA领域成果丰硕，但古DNA研究却一直充满了艰辛和挑战。

　　古DNA本身极易受到污染，实验要求极为精细，而以往古DNA提取和建库几乎全程依赖人工操作。付巧妹介绍，最近，在全球少数几个实验室中，部分古DNA实验步骤已经成功整合到了全自动移液机器人平台中，不仅极大节省了人力和物力，还减少了人工操作引入污染的风险。

　　“目前样品的前处理步骤仍只能依赖人工，如何把这项耗时、耗力的工作整合到自动化体系中，是古DNA实验技术需要攻克的下一道难关。”付巧妹指出。

　　此外，古DNA技术的应用远不止于人类古基因组。付巧妹介绍，通过古微生物DNA信息追溯古代疫病流行和共生微生物演化，利用古表观遗传学信息探究古代动物和环境的相互作用，以及利用古蛋白质探索更大时间尺度的人类演化，这些都是古分子的重要分支方向。在她看来，如何更有效地获取这些信息，并把信息进行多维度结合，是未来研究的难点之一。

　　古DNA是带着时间刻度的遗传信息，它从独特的视角书写了人类数万年来的演化与适应。这些岁月的痕迹不仅记录了人类的遗传历史，还在持续地影响着现今人群的生理和健康。

　　“我们推测，一些重要功能基因单倍型就来自于已灭绝古人类，这些基因涉及到先天免疫、脂代谢、高海拔适应性、肤色、新冠重症易感性等。此外，还有我们东亚人群特有的与头发和牙齿表型相关的基因型，也是在末次盛冰期之后频率升高，推测与环境适应性相关。”付巧妹表示。

　　此外，还有很多古DNA研究发现的特殊基因型的功能尚未确定。付巧妹认为，未来，可以通过构建动物模型并结合基因编辑技术对这些发现进行验证。“结合古DNA技术与现代前沿分子生物学技术，我们可以更清晰地理解演化史对当今人类健康的影响。”

　　相关论文信息：https://doi.org/10.1016/j.cell.2022.06.009